他们说眼见为实，但我们对化学系统的理解主要依赖于二手观察和测量。颜色的变化表明发生了反应，核磁共振峰显示了结构中的原子是如何连接的，对映体的过量测量表明了不同对映体的比例。但是，化学家通常看不到分子本身。
电子衍射比x射线衍射提供更详细的晶体图像。高能电子的波长较短，可以分析尺寸仅为20μm的微晶体，这意味着不需要生长大晶体。较大的晶体很难与某些蛋白质一起生长，比如跨膜的晶体，这限制了x射线晶体学的有用性
x射线和电子
晶体学是为数不多的例外之一，它将这些二次测量结果转化为决定性的3D结构。单晶x射线衍射-这些技术中使用最广泛的-已经有100多年的历史，是化学和生物学结构鉴定的金标准。当x射线射向晶体样品时，其规则的内部结构系统地散射光，通过记录这种衍射模式并向后工作，可以计算出分子的3D结构。
这种结构洞察力在精确药物对接和酶工程等领域至关重要，其中空间信息起着核心作用。然而，由于x射线与物质的相互作用相对较差，该技术需要大的晶体样品，通常在20-200μm之间，这意味着大多数小分子和蛋白质样品不适合分析。
另一方面，电子与物质的相互作用比x射线强1000倍左右，这使得分析只有十亿分之一大小的晶体成为可能。警告：由于样品损坏，只能从每个晶体中收集到单一图像，并且解释由此产生的衍射模式要复杂得多。
在检测过程中，有关绕射波的一些信息丢失了，因此必须手动组合从不同晶体样品收集的数百个单独的数据集，以推断缺失的细节并建立一个连贯的结构。同时，电子对物质更大的亲和力增加了二级和三级碰撞的次数——一种被称为动态散射的现象——这意味着衍射光束强度和分子结构之间的关系变得模糊。因此，电子衍射（ED）实验既困难又耗时，样品仅限于二维晶体，以避免动态散射。
MicroED诞生
膜蛋白尤其难以结晶，正是这种介于x射线的大晶体和ED的二维切片之间的尴尬中间地带所产生的挫败感，促使结构生物学家塔米尔·戈南开始将这些方法混合起来。
2004年，他的团队使用低强度ED解决了双层水通道蛋白晶体的结构。但是，他们并没有将不同晶体样品的图像组合在一起，而是使用x射线衍射中使用的方法从单个样品的衍射模式中计算回来，以恢复波的缺失信息。从技术上讲，两层样品是三维晶体，这也对动态散射限制电子衍射到单层晶体的断言产生了怀疑。“当时的问题是，为什么其他人不能解决3D结构？”戈南说。“我开始想，可能是他们收集和索引数据的方式存在限制。”
第一篇采用微ed的论文解决了双层水通道蛋白（一种膜蛋白）的结构问题
索引是衍射图样分析的一个阶段，涉及到确定衍射数据中每个峰的矢量（或轴）。对于x射线实验来说，这是一个相对简单的过程，因为从弯曲的图案中通常可以明显地看到三个轴。但电子衍射产生的是扁平的线状图案，因此无法可靠地识别第三个矢量。
“我意识到这是实验本身造成的。“x射线的波长相当大，所以散射角也很大，这就是为什么你可以解析出矢量，”戈恩解释说。在电子衍射中，波长要短得多，这意味着散射角也非常小。所以即使我们有一个三维晶体，本质上我们是取一个二维切片。“然而，如果可以从单个晶体样本中提取多个2D切片，那么每个图像就会在数学上相关，从而有可能找到第三个矢量并确定完整的3D结构。”
这一见解促使Gonen开发了一种称为microED的混合技术。将约50nm的微晶样品安装在可旋转的过渡电子显微镜（TEM）上，设置为衍射模式。然后，当低强度电子束射向样品时，舞台旋转，并用快速相机记录衍射。“我们团队开发的技术就是这种持续旋转的舞台。电子显微镜不是为运动而设计的，所以我们制造了控制器来协调舞台的运动和摄像机的记录，”戈南说。
然后，每个视频帧都用适应的x射线软件进行处理，生成高分辨率的3D结构。据Gonen说，这是该技术的另一个关键优势。x射线程序是非常完善和微小的修改，几乎每个供应商都支持，使现有的软件能够解释电子衍射模式，以及x射线。
解决蛋白质问题
该团队在2013年的概念验证研究中首次采用了这种新方法，解决了已知蛋白质溶菌酶的结构，并立即吸引了结构生物学界的兴趣。
对于专门研究神经退行性疾病的蛋白质生物学家大卫·艾森伯格（David Eisenberg）来说，微ed证明了一个10年前的问题的解决方案。艾森伯格的团队正在研究路易小体的结构，这是一种与帕金森病的神经损伤有关的蛋白质聚集体，但是被称为α-突触核蛋白的有毒核心单位被证明特别难以结晶。艾森伯格说：“这些晶体很小，只有100纳米，没有办法对它们进行操作，也没有办法把它们放入x射线束中。”
然而，这些微小的晶体是微型ed的完美尺寸。在看到Gonen 2013年的论文后，Eisenberg伸出了援手，在一周内，α-突触核蛋白的难以捉摸的结构被解决了，这是该技术确定的第一个未知蛋白质结构。
当microED被用于研究帕金森病时，难以捉摸的α-突触核蛋白的结构很快就被解开了
从那以后的几年里，微ed已经被用于解决许多其他具有挑战性的蛋白质结构，但在这项技术成为生物学主流之前，仍有几个实际问题需要解决。特别是，复杂的样品制备步骤需要高水平的技术专长。
蛋白质在其结构中自然携带水分。但电子显微镜必须在真空中操作，以避免空气的背景散射，这意味着实验条件有可能使蛋白质脱水并破坏其结构。Gonen说：“我们一直在冷冻晶体，当它在一层薄薄的冰中，保护它不受真空的影响。”“但接下来你会遇到一个棘手的问题，那就是，什么是冷冻水晶的最佳方法？”太厚的话，电子就无法穿透。太薄可能会压碎你的水晶。”
非生物样品的制备更简单，Gonen认为这种技术可能是小分子表征工具箱中特别有用的补充。
探测纯度和多晶
小分子通常比蛋白质更容易结晶，但大多数仍然无法形成足够大的晶体，无法进行结论性的x射线分析。因此，MicroED提供了大幅增加适合结构分析的分子范围的潜力，使化学家能够以相对较少的努力访问数百个数据点。Gonen说：“有了微型ed，我们可以获得大约95%的小分子的结构。”“这些结构通常是非常高分辨率的，在1Å标记附近，所以我们可以看到单个原子，并精确地知道氢键网络是什么。”这种类型的信息可以被输入到机器学习和精确药物对接中。”
至关重要的是，该技术还可以检测单个纯样品中存在的晶体形式（多晶型），这对制药行业具有极其重要的意义。药物多态性可以具有非常不同的物理性质，直接影响生物利用度，从而影响最终药物产品的有效性和安全性。活性化合物的不同形式也有资格获得单独的专利保护，因此公司在早期阶段识别多态性具有经济利益。高分辨率和小晶体尺寸使微ed成为x射线的灵敏和快速替代品，许多业内人士正在开始探索。
但除了识别晶体结构的混合物之外，Gonen的团队最近还编写了一种软件，使他们能够分析产品混合物。新代码收集样品中每个晶体的微ed数据，分别分析数据集，并提供单个晶体质量的估计。“我们可以结合这些数据进行相当彻底的成分分析。如果你有一种未知的混合物，你可以在没有任何先验知识的情况下确定其中的成分和每种成分的含量。该小组在阿司匹林和扑热息痛的药物样品上展示了这种新能力，最终分析结果与制造商列出的成分密切匹配。
Gonen的团队利用microED在混合物中识别出了一系列不同的止痛药。该技术还能够区分同一化合物的多晶型之间的差异，这对制药行业来说很重要
拒绝访问
但是，尽管这种技术对化学社区有多方面的优势，微ed在小分子化学家中仍然几乎闻所未闻。戈南承认，获取信息仍然是一个大问题。昂贵而专业的设备——透射电镜——加上进行微ed测量所需的技术知识，意味着对于那些没有晶体学方法经验的人来说，这项技术几乎是不可逾越的。戈南说：“我们已经编写了允许人们设置显微镜并自动收集数据的脚本，但设备所需的高水平专业知识是其局限性。”
超分子化学家Bernd Schmidt说，这个获取问题是阻碍其他领域的研究人员探索该技术潜力的关键因素。在表征方面，超分子化学占据了一个尴尬的中间地带。大的对称结构给出了看似简单的核磁共振谱，而弱键可以导致复杂的质谱破碎。x射线晶体学将是理想的技术，但超分子化合物的固有特性限制了该方法的有效性。
“处理和培养超分子单晶是非常具有挑战性的。我们的化合物本质上是不稳定的，因为它们是动态共价化合物，”施密特说。“我们有这些巨大的分子和巨大的细胞，其中的溶剂或客体在孔隙中是有序或无序的，这本质上导致低角度衍射和低分辨率图像。”
施密特认为，微型教育将为这一困境提供理想的解决方案。小晶体尺寸和快速采集时间可以极大地简化工作流程，使研究人员不仅可以更有效地表征最终材料，而且可以在早期阶段了解样品的拓扑结构和几何形状，甚至可能扫描反应混合物以跟踪自组装过程。
然而，目前，他只能推测这项技术如何能加强他的研究。“大学里可用的TEM机器已经完全用于其他目的，所以可供使用的设备非常有限。”他说，知识和软件的进入门槛也很高。“我认为，当有人将这些技术融合成易于使用和用户友好的产品时，就会出现大爆发。”
可访问性的自动化
正是这些错失的机会激发了分析仪器公司里加在2021年推出XtaLAB Synergy-ED的灵感。Rigaku的首席科学官Joe Ferrara解释说：“我们认为[microED]是一种很有前途的技术，它将对我们目前销售x射线设备的同一组科学家有用。”“我们的模型是，只需几分钟的训练，就能有人走到XtaLAB Synergy-ED前，立即收集数据。”
日本仪器制造商Rigaku的目标是让所有人都能使用microED，而不仅仅是显微镜专家，它的XtaLAB Synergy-ED
与Gonen和Eisenberg等学者使用的tem不同，XtaLAB Synergy-ED是专门为微ed实验设计的，具有自动数据收集、图像处理和分析功能，使完全的晶体学新手也可以使用该技术。Rigaku单晶业务负责人本森（Mark Benson）说，它将微型ed从一个研究项目中提取出来，并将其发展成为一种商业工具。“潜在的市场是巨大的，但很少有科学家意识到电子衍射能如何帮助他们。”
意识是驱动需求的关键因素，费拉拉说，早期的兴趣主要来自已经使用电子衍射的MOF/COF社区。从那以后的几年里，Rigaku收到了制药和电池行业的咨询，以及更多的利基应用，如博物馆藏品的样本分析。
Benson说，现在的挑战是让拨款审查员相信微型ed的潜力，并确保必要的资金到位，使各部门和公司能够投资这项技术。新机器的起价约为150万欧元（130万英镑），大致相当于一台中程核磁共振机器，去年理学向位于南安普顿的英国国家电子衍射设施的世界上第一台专用国家微型ed服务提供了两台机器。
最终，他们希望微型ed能成为化学分析的常规部分，而不是一种专业技术。费拉拉说：“在5到10年内，我们的愿景是每所主要大学都将配备一台这样的仪器。”
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